SOLUÇÃO DE FENILFOSFATO PARA TESTE DE FOSFATASE ALCALINA

A solução de fenilfosfato é um reagente utilizado em testes laboratoriais para determinar a atividade da fosfatase alcalina em alimentos, especialmente no leite e derivados. A fosfatase alcalina é uma enzima naturalmente presente no leite cru, mas é inativada durante o processo de pasteurização. A presença de fosfatase alcalina no leite indica que ele não foi pasteurizado adequadamente ou que foi contaminado após a pasteurização.

Na indústria alimentícia, a solução de fenilfosfato é utilizada para realizar o teste de fosfatase alcalina, que serve para verificar a eficácia do processo de pasteurização do leite e derivados. Esse teste é um importante indicador de segurança alimentar, pois a presença de fosfatase alcalina pode indicar a presença de microrganismos patogênicos que podem causar doenças. 

O teste de fosfatase alcalina é realizado adicionando a solução de fenilfosfato ao leite ou derivado lácteo. Se a fosfatase alcalina estiver presente, ela irá quebrar o fenilfosfato, liberando fenol. A presença de fenol é detectada por meio de uma reação colorimétrica, que indica a presença de fosfatase alcalina e, consequentemente, a ineficácia do processo de pasteurização. 
 

Fosfatase Alcalina:

A verificação da atividade enzimática é feita mediante a adição à amostra do substrato específico da enzima em condições ideias para sua atuação. A presença do indicador permite identificar a atividade enzimática pela reação colorimétrica com os produtos de degradação.

Materiais:

*Banho-maria;
*Pipeta graduada de 1 mL;
*Pipeta graduada de 5 mL;
*Tubo de ensaio com tampa; e
*Estante para tubos de ensaio;

*Catalisador: dissolver 0,2 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5 H2O) p.a. em 100 mL de água. Solução reagente: pesar 0,150 g de 2,6-dicloroquinona cloroimida (C6H2Cl3NO) p.a., dissolver em 50 mL de álcool etílico p.a., transferir para frasco âmbar e estocar em geladeira. A coloração da solução recentemente preparada é amarelo-citrina, passando a amarelo ouro e tendendo a escurecer, adquirindo tons amarronzados com o envelhecimento. Recomenda-se usar a solução por um período máximo de duas semanas, desde que conservada sob refrigeração e ao abrigo da luz.

*Substrato: pesar 0,5 g de fenilfosfato dissódico dihidratado (C6H5Na2O4P.2 H2O) p.a. em um béquer, dissolver com o tampão diluído, transferir para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com o tampão diluído. Recomenda-se usar esta solução durante um período máximo de duas semanas.

*Tampão carbonato: pesar 46,89 g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3) p.a. e 37,17 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3) p.a., dissolver e levar ao volume de 1000 mL (solução estoque). Retirar uma alíquota de 25 mL da solução estoque, transferir para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume. O pH deste tampão diluído deverá situar-se entre 9,5 e 9,7.

Procedimento:

*Transferir 0,5 mL da amostra para um tubo de ensaio;
*Adicionar 5 mL do substrato e tampar:
*Agitar ligeiramente e levar ao banho-maria mantido entre 39 e 41 °C durante 20 minutos e esfriar o tubo de ensaio em água corrente; *Adicionar 6 gotas de solução reagente e 2 gotas do catalisador;
*Levar o tubo novamente ao banho-maria entre 39 e 41 °C por 5 minutos; e
*Repetir o mesmo procedimento acima descrito, usando, em lugar da amostra e em diferentes tubos, 0,5 mL de leite cru e 0,5 mL de leite fervido.

Resultado:

*Positivo Coloração azul intensa: leite cru (positivo para atividade de fosfatase alcalina).
*Negativo Coloração cinza: leite pasteurizado (negativo para atividade de fosfatase alcalina).

Dicas:

*Deve-se ter cuidado no preparo dos reagentes e atenção em sua forma de armazenamento e principalmente ao prazo de validade.
*Os tubos de ensaio devem encontrar-se perfeitamente limpos e sem qualquer vestígio de detergentes, em decorrência do processo de lavagem do material.
*A tonalidade do azul do resultado vai ficando tanto mais intensa, quanto maior for a deficiência de pasteurização.
*As provas positivas devem ser repetidas cuidadosamente, principalmente se forem usados reagentes com algum tempo de preparo.
*A amostra deverá sofrer cuidadosa agitação antes de ser analisada, visando distribuir a gordura ou a camada de creme pelo líquido. A retirada de uma alíquota da amostra a partir da sua camada superior poderá levar a resultado positivo ou suspeito, ainda que o leite tenha sido adequadamente pasteurizado. A fosfatase alcalina encontra-se adsorvida aos glóbulos de gordura.
*A fosfatase alcalina poderá sofrer reativação após algum tempo de pasteurização do leite. Não é comum encontrar esse tipo de interferência, mas o analista deverá ter em conta a vida de prateleira do produto ao ser analisado, principalmente se o teste for conduzido depois de 24 horas de o leite ter sido processado.